Recherche de l'Université de Kanazawa : des chercheurs définissent un protocole de fabrication de nanopipettes pour l'imagerie cellulaire haute résolution

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22 août 2023, 04 h 03 HE

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KANAZAWA, Japon, 22 août 2023 /PRNewswire/ -- Des chercheurs de l'Université de Kanazawa rapportent dans Analytical Chemistry comment produire des nanopipettes qui fournissent de manière fiable des images de microscopie à conductance ionique à balayage de résolution nanométrique de cellules vivantes.

Une vue à l’échelle nanométrique des cellules vivantes peut fournir des informations précieuses sur la structure et la fonction cellulaire. Au fil des années, diverses techniques de microscopie ont été utilisées pour obtenir une fenêtre sur des spécimens biologiques à l'échelle nanométrique, mais toutes ont leurs limites et leurs défis. Bien que la microscopie à conduction ionique à balayage (SICM) ait démontré sa capacité à imager des échantillons biologiques vivants en solution avec une résolution à l'échelle nanométrique, elle a été entravée par les défis liés à la production fiable de nanopipettes présentant la géométrie optimale pour cette tâche. Aujourd'hui, des chercheurs dirigés par Yasufumi Takahashi du Nano LSI de l'Université de Kanazawa et de l'Université de Nagoya ont mis au point un protocole permettant de fabriquer de manière reproductible des nanopipettes avec la géométrie préférée pour une imagerie de haute qualité. La microscopie à conductance ionique à balayage (SICM) utilise une nanopipette pour contrôler la distance nanopipette-échantillons en utilisant un courant ionique comme signal de rétroaction. La forme de la nanopipette influence considérablement les performances de l’appareil. Par exemple, une grande ouverture limite la résolution possible, un long shunt peut conduire à des effets de rectification qui faussent les mesures de courant ionique, et si le verre de la nanopipette est trop épais, il peut déformer l'échantillon avant que la proximité de l'ouverture n'atteigne la valeur maximale. point nécessaire à la cartographie topographique à courant ionique constant. En conséquence, la nanopipette idéale présente un shunt court, une petite ouverture et de fines parois de verre.

La procédure standard de fabrication de la nanopipette consiste à tirer un tube capillaire avec un extracteur laser qui chauffe le tube capillaire qu'il manipule. Le capillaire se rétrécit ensuite là où il s'allonge jusqu'à ce qu'il soit finalement dessiné en deux morceaux distincts. Bien que le quartz puisse permettre un peu plus de contrôle dans le processus de mise en forme du tube capillaire, il est hydrophobe, ce qui complique le remplissage de la nanopipette avec la solution aqueuse nécessaire au courant ionique. Pour cette raison, les chercheurs ont développé un protocole grâce auquel ils pourraient extraire des nanopipettes de capillaires en verre borosilicaté avec le contrôle et la reproductibilité requis.

Takahashi et ses collaborateurs ont noté qu'idéalement, le capillaire de départ devrait avoir des parois épaisses et un diamètre intérieur étroit, mais il n'est pas facile d'obtenir des tubes capillaires répondant à ces exigences auprès de fournisseurs commerciaux. Au lieu de cela, ils préchauffent le capillaire pendant 5 s sans le tirer, ce qui provoque un épaississement des parois de verre et une réduction du diamètre intérieur. Ils ont également optimisé les paramètres de traction du tube, comme la vitesse.

Les chercheurs ont démontré les performances des nanopipettes qu’ils ont produites en imagerie d’une cellule subissant un type d’endocytose, où elle engloutit et absorbe du matériel externe. Ils ont pu visualiser les microvillosités – saillie de la membrane cellulaire – à la surface des cellules, les puits endocytaires qui se forment et la formation d'un capuchon fermant le puits. Les tentatives antérieures visant à imager la formation de la calotte ont été inhibées par les limitations de la résolution spatiale.

Les chercheurs ont même pu résoudre des vésicules extracellulaires aussi petites que 189 nm libérées au cours du processus. Comme ils le soulignent dans leur rapport, il existe de plus en plus de preuves que ces vésicules extracellulaires jouent un rôle important dans la communication entre les cellules et l'homéostasie, avec des applications diagnostiques et thérapeutiques axées sur les plus petites vésicules extracellulaires entre 40 nm et 150 nm en particulier. Les chercheurs concluent dans leur rapport : "Nous envisageons que ce protocole aidera à fabriquer de manière reproductible des nanopipettes en borosilicate pour la cartographie topographique à haute résolution à l'aide du SICM."

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